真核生物编码核糖体RNA基因的rDNA是具有多个拷贝的简单重复序列，每个重复序列包含1个跨越18S、5.8S和28S rDNA 拷贝区的内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)，其中包括5.8S RNA基因。真核生物ITS区间的DNA序列具有很高的保守性，已广泛用于种间、属间的分子系统学研究(蔡金娜等, 2000; Jeewon et al., 2003; Yuan et al., 2009)，也被广泛应用于生物的种间鉴别(Douzery et al., 1999)。本研究选择一例疑似空气污染物伤害松树的司法鉴定案作为研究实例。该实例是由湖南农业大学司法鉴定中心2010年7月受理的一个司法鉴定案。案例背景是：湖南省永州市道县仙子脚镇下石塘村一片松树枯死，怀疑因受附近冶炼工厂尾气污染造成损失而诉讼冶炼工厂。委托方(法院)要求鉴定送检样品是否为附近冶炼工厂尾气污染导致。在现场勘察、初步形态鉴定的基础上，应用ITS序列分析鉴定了对疑似空气污染物伤害松树的病原做了分子水平上的鉴定。

1结果与分析
1.1疑似污染区现场勘查
空气污染物对植物造成伤害的特点是具有成片性，且对植物没有选择性。松树成片针叶枯死脱落的地方在离冶炼厂较远处的一块地，而在离冶炼厂更近的地块仅发现1株松树有此症状，且旁边的松树都正常，这不符合污染物损害的规律。在怀疑受到污染物伤害的区域内还有农民诉水稻受到污染物损害而发黄，但紧邻的另几块水稻田未见叶片发黄，邻近的玉米也未见污染损害迹象；有农民诉黄花菜受到污染物损害，然而现场勘查结果是锈病引起，与污染物无关。综合上述现场勘查的结果，判断松树针叶枯死并非化工厂释放的空气污染物所致。

1.2菌株的分离及显微观察
松树叶片枯死处，仔细观察可以看到叶片上有小黑点(图1)，用病组织制成玻片，未发现病原孢子。病斑采用真菌常规分离法分离到一白色菌落真菌，PDA上培养8 d后产生黑色孢子堆，显微镜下观察(图2)，分生孢子梭形或椭圆形，5个细胞，分隔处缢缩，中间3个细胞褐色，两端细胞圆锥形，无色，顶端有2~3根无色刺毛。根据病原菌培养基上生长情况和镜检孢子情况，初步鉴定该菌为拟盘多毛孢属(Pestalotipsis)真菌。

图1样品病害症状                    Figure 1 Disease symptoms of the samples

图2样品病菌显微图(10×40) Figure 2 Micrographs of sample’s pathogen (10×40)

1.3样品ITS序列扩增、测序、比对与系统进化分析
采用真菌核糖体通用引物ITS4和ITS5进行PCR扩增并测序获得长度561 bp的ITS序列，序列结果如下。


将测序所得序列在NCBI数据库中进行Blast比对搜索，结果表明，最接近的序列都分布在拟盘多毛孢属中(表1)，序列覆盖范围(query coverage)均达到97%。最大相似性(max identity)均在99%以上。

表1样品ITS序列的Blast比对  Table 1 Blast result of the sample ITS sequence

从比对结果中下载相似性较高的2条同源序列AB251916、AF377290，将此2条序列与拟盘多毛孢属基本物种ITS序列、作为外群的JF303032 (Lysinibacilus fusiformis cT185) ITS 序列，一起构建系统进化树(图3)。从系统进化树大体可以看出最接近的序列都分布在拟盘多毛孢属(Pestalotipsis)中，且与P. vismiae SN-3的ITS序列(AB251916)在进化树上处于同一小的分支，由此判断，该菌(daoxian isolate 20100919)系韦司梅拟盘多毛孢(Pestalotipsis vismiae)。

图3样品ITS序列及基本物种ITS序列的NJ系统进化树 Figure 3 The NJ phylogenetic tree based on the ITS sequences of sample and the basic species

2讨论
拟盘多毛孢属真菌中的一些种是重要的植物病原菌，所引起的病害世界各地均有分布。拟盘多毛孢属危害松科植物主要引起叶部病害，病原菌以分生孢子和菌丝体在病叶中越冬，孢子靠雨水传播，危害重时松林火烧一般，提早落叶，严重影响生长。蔡竹固和李明仁(1997, 林木病虫害研讨会论文集, pp.89-96)对台湾地区针叶树拟盘多毛孢叶枯病进行了调查时，发现主要由枯斑拟盘多毛孢(P. funereal)、白井纳拟盘多毛孢(P. shiraiana)、污斑拟盘多毛孢(P. foedans)、掌状拟盘多毛孢(P. palmarum) 4种真菌引起。此外，Suto and Kobayashi (1993)报告日本针叶树种上Pestalotiopsis有10种，即忽视拟盘多毛孢(P. neglecta)、三尖杉拟盘多毛孢(P. cephalotaxi)、污斑拟盘多毛孢(P. foedans)、栎拟盘多毛孢(P. glandicola)、广布拟盘多毛孢(P. disseminata)、枯斑拟盘多毛孢(P. funerea)、茶褐斑拟盘多毛孢(P. guepini)、长刺拟盘多毛孢(P. longiaristata)、罗汉松拟盘多毛孢(P. podocarpi)及日本香柏拟盘多毛孢(P. thujicola)。上述研究中均未提及P. vismiae引起松叶病害。而张家祥(2002)从中国南方各省采集到800多份植物病害标本，通过分离鉴定获得了150余个拟盘多毛孢属菌株，寄主植物覆盖了49个科，其中就有P. vismiae危害松科植物的记录。拟盘多毛孢属是个无性属，不是分类学上的属，目前的分类仍然处于比较混乱的状态没有一个比较完善的体系。拟盘多毛孢属下各种的分类主要依赖形态特征的尺度变化范围，且各学者的看法不一，在已发表的各种中，种间形态的尺度差异微小，许多种的形态尺度相互重叠，不同的人可能将同一个菌株鉴定成不同的种。 目前，分子系统学研究表明，拟盘多毛孢属的形态特征和分子特征具有一定的对应关系(Jeewon et al., 2002; 2003; 韦继光等, 2005)，因此，形态特征与分子特征相结合进行种的确认和命名是可行的方案。

3材料与方法
3.1现场勘查及样品采集
2010年7月21日至22日，湖南农业大学司法鉴定中心三名执业资格鉴定人在委托鉴定的松树种植地(湖南省永州市道县仙子脚镇下石塘村)及周边进行了勘查。现场鉴定时3家从废矿渣中提炼锰的冶炼工厂都已停产，未见烟雾排出。在工厂查看了冶炼厂所用燃料为焦炭。

勘查了松(Pinus spp)树附近的植物，包括烟草(Nicotiana tabacum L.)、水稻(Oryza sativa L. )、玉米(Zea mays L.)和黄花菜(Hemerocalis fulva L.)等作物的受害情况。

采集了冶炼厂附近针叶枯死脱落的松树枝条。

3.2病原菌的分离与形态学观察
用保湿培养法对样品进行表面带菌检验。用底部铺有3 层滤纸，直径为9 cm 的灭菌培养皿作培养床。先用无菌水润湿滤纸，取样品材料放在滤纸上，置于25℃温箱中培养。病斑采用真菌常规分离法进行分离，分离到的真菌转移至PDA 培养基上纯化培养，然后进行转管保存。

根据分离真菌的培养性状和显微形态特征(Guba, 1961; Sutton, 1980)，参考有关工具书和资料进行属或种的鉴定(陈育新等, 2002, 菌物系统, 21(3): 316-323; 陈育新等, 2003; Wei and Xu, 2004)。
 
3.3 DNA提取
将分离菌株接种到PDA平板上进行活化，于28℃培养箱中黑暗培养6d后，用灭菌的药匙将菌丝刮下，称取0.5 g于1.5 mL的EP管中，加入1 mL CTAB裂解液(张妙彬等, 2009)，3/10体积的石英砂，研磨；65℃水浴10 min，然后加入600 μL 7.5 mol/L的NaCl溶液，冰浴8 min后13 000 r/min离心5 min；取600 μL上清到一个新的EP管中，加400 μL的氯仿:异戊醇(24: 1)，混匀；静置分层后取500 μL上清至另一新的EP管，加入0.1倍体积NaAc和2倍体积的无水乙醇，离心8 min后收集DNA，用70%乙醇洗DNA两次；待乙醇挥发后，用0.1×TE溶解DNA，-20℃保存。 

3.4 PCR扩增ITS序列 
采用真菌核糖体通用引物ITS4 (5'-TAATCCGCTTATTGATATGC-3')和ITS5 (5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')进行PCR扩增。PCR反应体系总体积为50 μL，反应体系为：10×PCR buffer 5 μL，dNTP (10mmol/L) 1 μL，Taq酶(2.5 U/μL) 1 μL，引物ITS4和ITS5各2 μL (25 μmol/L)，模板DNA (500 ng/ul) 1 μL，在PCR扩增仪上进行扩增。PCR扩增条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，共30个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保存。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，用凝胶成像仪进行观察并拍照。PCR产物委托生工生物工程(上海)有限公司进行测序。 

3.5 ITS序列比对与系统进化分析
我们将测得序列在NCBI 数据库中进行BLAST比较搜索，下载同源性序列，用MEGA4.0 软件包进行系统进化分析，构建系统进化树。

作者贡献
周倩负责病原物的分离纯化、显微观察和论文写作，刘燕娟负责真菌DNA的提取与ITS序列的扩增，陈俊如负责ITS序列分析和系统发育树的构建，夏花和高必达负责现场调查和取样。高必达负责试验指导。

致谢
感谢湖南道县仙子脚镇下石塘村村民在现场调查中提供的信息与配合。感谢两位匿名的同行评审人的评审意见和修改建议。

参考文献
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